トランジェント(一過性発現)で実験する場合 細胞を回収してqRT-PCRなどでノックダウン効率を検証する。 B. ステーブル(安定発現)で実験する場合 培地を適当量の ピューロマイシン を含む培地に交換する。細胞により至適濃度は異なりますが、1~10 μg/mLが標準的。 <5日目以降(ステーブルの場合のみ)> 3~4日ごとに培地を適当量の ピューロマイシン を含む培地に交換する。(一般的に10 ~ 12日後くらいでクローンが確立)。 5クローン以上をピックしてノックダウン効果を検証する。 以上、shRNAレンチウイルスによるノックダウンプロトコールを紹介しました。このように数日間にわたって実験を行う場合は、失敗して貴重な時間とサンプルを無駄にしないためにも、事前に手順を頭に入れ、しっかりと準備を整えてから行いましょう。 <無料PDFダウンロード> MISSION ® RNAi 総合カタログ このカタログではRNAiの原理やプロトコル、使用する製品についてご紹介しています。 ▼こんな方にオススメ ・RNAiの基礎を学びたい方 ・これからRNAi実験に取り掛かる予定の方 ・MISSION RNAi製品ならではの特長を知りたい方 無料PDF(MISSION ® RNAi 総合カタログ)をダウンロードする
A1 三好博士によると、約8kbまで挿入できることを確認していますが、インサートが大きいとtiterは落ちます。他のグループの論文 (Hum Gene Ther 12: 1893-1905, 2001) では16kbくらいの大きさまで入るという報告がありますが、やはりtiterは落ちるようです。 また、ベクタープラスミドのサイズが大きいため、サブクローニングが難しいかと思いますので、Gatewayのベクターのご使用をお勧めいたします。 Q2 Transfectionの時、CO 2 インキュベーターを3%にするのはなぜ? RNAi実験の基礎 shRNA レンチウイルスによるノックダウン | M-hub（エムハブ）. A2 リン酸カルシウム法に関しましては、Mol Cell Biol 7: 2745-2752 (1987)を読んでいただければ詳しく出ています。10%と5%ではtransfectionの効率に大きな差がありますが、5%と3%では3%の方が多少よい程度です。インキュベーターに余裕あれば3%をお勧めします。 Lipofectamineなどのリポソーム法でも問題はありませんが、 リン酸カルシウム法で293Tに100%入りますので、安くて経済的です。 Q3 Transfectionの際、Forskolinの役割は? A3 Forskolinはadenylate cyclaseを活性化してcAMPが増加しPKAを活性化することにより、間接的にCMVプロモーターに働き、CMVプロモーターの転写活性をあげます。多くのプラスミド(特にベクター)はCMVプロモーターでドライブしていますので、Forskolinを加えることによりtiterが上がります。 Q4 cPPTとは? A4 レトロウイルスは逆転写の際、3'LTRの直上流にあるPPT(polypurine tract)配列からプラス鎖の合成が始まるが、HIV-1にはゲノムの中央部分にcPPT(central polypurine tract)と呼ばれる同じ配列がもう一カ所あり、ここからも合成が行われるため、最終的な二本鎖cDNAには中央にDNAフラップと呼ばれる約100塩基対の3本鎖構造ができる。cPPT配列は逆転写の効率に影響を与えることが示唆されており、cPPT配列をベクターに組み込むことにより、遺伝子導入効率が高くなるといわれています。 Q5 WPREの役割は? A5 WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)は、mRNAの核から細胞質への能動的な輸送と細胞質でのmRNAの安定性を高める役割があるとされています。この配列をベクターに組み込むことにより、titerおよび導入遺伝子の発現効率が上がることが報告されています。 Q6 SINベクターとは?
で作製したウイルス結合プレートの溶液を除去し、速やかに細胞懸濁液を加える。 標的細胞とウイルスベクターの接触を促す目的で、細胞添加後、遠心操作を行っても良い。例えば500× g 、1分間遠心など。 37℃、5% CO 2 インキュベーターで培養する。 Lentiviral High Titer Packaging Mix with pLVSINシリーズ
A10 VenusはEYFPのVariantで、理研BSIの宮脇敦史先生により開発されました(Nat Biotechnol 20: 87-90, 2002)。細胞にもよりますが、VenusはEGFPやEYFPよりも数倍から10倍くらい明るく、蛍光顕微鏡やFACSではEGFPと全く同様に扱えます。IRESベクターでは、IRESの下流の遺伝子の発現がかなり低くなりますので、Venusを使用することをお勧めします。 Q11 導入遺伝子の発現レベルが低いのですが。 A11 レンチウイルスベクターでは、組み込んだ遺伝子の発現に内部プロモーターを使用するので、標的細胞において高発現のプロモーターを内部プロモーターとして使用することが重要です。CMV、EF-1α、UbC、CAGプロモーター等での比較や、組織特異的なプロモーターの使用をご検討下さい。 また、遺伝子導入効率が悪い場合には、細胞毒性のでない範囲でMOI(multiplicity of infection)を上げて下さい。 Q12 レンチウイルスベクターによるsiRNAの発現レベルは? A12 レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターもそうですが、single integrationですので、発現量があまり高くないのが問題となります(H1またはU6 promoter)。したがって、endogenousのtarget geneの発現量が多い場合には、ノックダウンの効果が弱くなります。MOIを上げてmultiple integrationにすることによりある程度解決しますが、やはり発現プラスミドのtransient transfectionに比べると弱いようです。また、3'LTRにsiRNA発現unitを挿入したベクター(コピー数が2になります)でも、基本的にあまり効果は変わりません。いずれにしても、よく利くtarget siteを選ぶことは重要です。 Q13 マクロファージへの遺伝子導入効率が悪い A13 第3世代packaging plasmidでは、vpr欠損のため、マクロファージへの遺伝子導入効率が他の細胞と比べて1桁近く下がります。vprを含むすべてのaccessory geneの入ったpackaging plasmidを使用するか、MOIを上げることにより解決されると思います。また、マクロファージで高発現のプロモーターを内部プロモーターとして使用することも重要です。 (MAN0034j) 2021.
今回も実験 プロトコール です。 この目的は、自分の頭の整理・知識の確認の他に、いわゆる「おばあちゃんの知恵袋」的な、文献や教科書に載っていないけど知ってるとちょっと役立つようなことを記録しておくことです。 正確性には注意を払っておりますが、利用の際はご注意ください。 レンチウイルス関連の記事は以下の通り↓ レンチウイルスベクターの保存方法【短期保存】 - こりんの基礎医学研究日記 レンチウイルスベクターの保存方法 - こりんの基礎医学研究日記 【実験プロトコール】ウイルスタイターチェック - こりんの基礎医学研究日記 以下の プロトコール をもとに、ラボの先輩に教えてもらった方法です↓ 直径10㎝ディッシュを用意し、Poly-L-Lysineコーティングする。 ※Poly-L-Lysine(PLL)とは? 細胞膜上の陰イオンと培養容器表面上の 陽イオン との間の相互作用を促進する。つまりプラスチックやガラス面への細胞接着を促進する効果がある。 →省略してもあまり実験に影響ない印象 <やり方> 0.
【本書名】実験医学別冊 目的別で選べるシリーズ:目的別で選べる遺伝子導入プロトコール〜発現解析とRNAi実験がこの1冊で自由自在!最高水準の結果を出すための実験テクニック 【出版社名】羊土社 お近くに取扱書店が無い場合,特に 海外 でご覧になりたい場合,羊土社HPでのご注文および発送も承っておりますので,下記ご参照のうえ,注文をご検討ください. 羊土社HPでのご注文について 本書を羊土社HPにてご購入いただきますと,本体価格に加えて,送付先・お支払い方法などにより下記の費用がかかります.お手続き等詳細は 書籍購入案内のページ をご参照ください. 分類 項目 費用 国内 消費税 +520円 送料 0円(5, 000円以上,国内送料無料) 手数料(代引きのみ) +300円 海外 航空便送料 第1地帯(アジア、グアム、ミッドウェイ等) +1030円 第2地帯(オセアニア、中近東、北米、中米) +1320円 第2地帯(ヨーロッパ) 第3地帯(アフリカ、南米) +1730円 EMS便送料 +1680円 +2360円 +2600円 +3080円 ※この表は本書のみご購入いただいた場合の費用をまとめたものです.他の書籍を同時に購入する場合はお申し込み金額や重量により費用が異なってまいりますのでご注意ください.
遅延損害金 いわゆる「延滞金」にあたるものです。 レンタルDVDの返却に遅れた時と同じ形で、遅延損害金が発生します。 また、遅延損害金の額は下記の式で計算されます。 【ショッピング】 遅延損害金=請求金額(元金)×遅延損害金年率÷365日×遅延日数 【キャッシング】 遅延損害金=借入残高×遅延損害金実質年率÷365日×遅延日数 2. カード利用停止 引き落としができなかった時点で、三井住友VISAカードの利用が停止されます。 「昨日まで使えていたのに、突然使えなくなった…」 という場合は、遅延が原因で利用停止になっている恐れがあります。 3. 引き落としできなかったのですが、どうすればいいですか？. 三井住友カードの社内データに記録 「遅延した」「引き落としができなかった」という情報が、三井住友カードの社内データに記録されます。 外部機関(信用情報機関など)には共有されないものの、三井住友VISAカードを利用するうえで不都合が生じます。 (増額審査で不利になるなど) 4. 催促の連絡 連絡せずに放置していると、三井住友カードの担当者から「催促の連絡」が届きます。 はじめはスマホ(携帯)に電話がきます。 これを無視する(対応しない)と、自宅や勤務先に電話がくるようになります。 5. 滞納が続くと延滞扱いになる 遅延(滞納)が長引くと、延滞扱いになります。 延滞扱いになると、遅延よりもさらに重いペナルティが課せられます。 最悪の場合、三井住友VISAカードの強制解約措置がとられ、残高の一括請求が届きます。 入金できない・引き落としに間に合わない時は電話連絡を! 【ここでのポイント】 すぐに電話連絡をする 引き落としに間に合わないことを正直に伝える 放置は絶対ダメ!延滞金などが生じる恐れあり 引き落としに間に合わない、入金に遅れそう。 という時は、1分1秒でも早く 「三井住友カード 信用管理部」に電話 をしてください。 【三井住友カード 信用管理部】 東京:03-6738-7130 大阪:06-6223-6511 受付時間:平日9時〜17時 (土日祝日・年末年始休) 電話をしたら、引き落としに間に合わない旨を正直に伝えましょう。 そして、オペレーターと相談しながら、支払日と支払い方法を設定しましょう。 Q:再引き落としもできなかった場合、延滞金はいくら生じる? 利用残高や遅延日数(振込までにかかった日数)によって、生じる延滞金が異なります。 まず、延滞金は下記の式で計算します。 延滞金(遅延損害金)=利用残高×遅延損害金年率÷365日×遅延日数 ショッピング枠の年率→14.
磁気不良 三井住友銀行のキャッシュカードは、 磁気不良 を起こすことがあります。 例えば、 他のキャッシュカードの磁気と干渉する クレジットカードの磁気と干渉する 経年劣化で磁気が弱くなる 手帳型スマホケースの磁石の影響を受けた …といったことが原因で磁気不良を起こします。 磁気不良は自然回復する症状ではありません。 なので、所定の方法でキャッシュカードを再発行する必要があります。 2. 破損・変形 三井住友銀行のキャッシュカードは消耗品です。 また、それほど頑丈なものではありません。 地面に落とした衝撃で割れてしまう、他のカード類に圧迫されて変形してしまう。 さらに、長く使うほど劣化していきます。 磁気不良と同じく、劣化は回復する症状ではないので、再発行が必要になります。 もう一点。 変形・破損したキャッシュカードは、絶対に使ってはいけません。 ATMから出てこなくなるなど、二次トラブルの恐れがあるからです。 3. 【三井住友銀行引き落とし】時間はいつ？残高不足だと問題発生？. 紛失 財布をまるごと落としてしまったとか、たまたまキャッシュカードを無くしてしまったとか。 このような場合も再発行が必要になります。 ただし、紛失した場合は再発行よりも先に「 利用停止 」の手続きをしてください。 不正利用される可能性がゼロではないので、まずは利用停止手続きをしましょう。 4. 盗難 いつ・何時・どんなタイミングで盗難にあうか?わかりません。 財布やカードの盗難にあったら、こちらも 利用停止の手続きを最優先 してください。 盗難・紛失ダイヤルは24時間受け付けているので、時間や曜日に関係なくすぐ電話しましょう。 まとめ 再発行手数料として1, 000円(税別)かかる
クレジットカードの引き落とし日に、「指定口座への入金を忘れていた」という経験はありませんか? 当日に入金 しても間に合うのかどうか、 延滞金などの罰則 はあるのかどうか、 信用情報に傷 がついてしまうのかどうかなど、気になりますよね。 今回は、 クレジットカードの引き落とし時間 や、 手元にお金が準備できない場合の対処法 をまとめて解説します。 クレジットカード引き落とし時間は、金融機関によって違う!
もし、残高不足になってしまった場合には、 誠実に対応して早めにお金を返しましょう♪
三井住友銀行の届出印がどれか分からなくなった。もしくは紛失してしまった。 この場合は、 届出印の変更手続き が必要になります。 届出印の変更に必要なもの 通帳もしくはキャッシュカード 新しく登録する印鑑 どこの店舗でも手続きできますが、取引店以外の店舗で手続きすると、登録が反映されるまでに1週間ほどかかってしまいます。 取引店で手続きすれば、その場で反映されます。 なので、急ぎであれば取引店で手続きをしましょう。 そして、そのままキャッシュカードの再発行手続きに移りましょう。 代理人に依頼するなら「委任状」と「本人確認資料」が必要!