Lentivirus Vector レンチウイルスベクター レンチウイルスベクターについて レンチウイルスベクター Plasmidリスト プロトコールとQ&A プロトコール Lentiviral Vector Preparation (pdf) [ in English / in Japanese] Lentiviral Vector for RNAi (pdf) [ in English / in Japanese] Lentiviral Vector for Inducible RNAi (pdf) [ in English / in Japanese] Transduction of Human Hematopoietic Stem Cells (Miyoshi, H. Gene delivery to hematopoietic stem cells using lentiviral vectors. Methods Mol. Biol. 246:429-38, 2004. PMID: 14970608) レンチウイルスベクターQ&A (三好浩之博士による) レンチウイルスベクター全般に関しましては、以下の総説をご参考下さい。 三好浩之:レンチウイルスベクター 最新医学 幹細胞研究の最近の進歩(最新医学社)Vol. 64 (3月増刊号), 232-242 (2009). 三好浩之:レンチウイルスベクター バイオ医薬品の開発と品質・安全性確保(エル・アイ・シー), 612-625 (2007). 三好浩之:蛍光タンパク質遺伝子導入法 レンチウイルスベクターによる導入 バイオテクノロジージャーナル(羊土社)7, 97-105 (2007). 三好浩之:遺伝子導入法(レンチウイルスベクター) 実験医学(別冊) 免疫学的プロトコール(羊土社), 127-137 (2004). 三好浩之:レンチウイルスベクターを用いた造血幹細胞への遺伝子導入 ウイルス Vol. RNAi実験の基礎 shRNA レンチウイルスによるノックダウン | M-hub（エムハブ）. 52, 225-231 (2002). 三好浩之:レンチウイルスベクターによる非分裂細胞への遺伝子導入 細胞工学(秀潤社) Vol. 20, 1234-1242 (2001). 作製方法については、まず日本語のプロトコールをご覧下さい。 レンチウイルスベクターの遺伝子組換え実験レベルについては、「 レンチウイルスベクターについて 」をご覧下さい。 Q1 ベクターに挿入できるインサートの大きさはどれくらいまででしょうか?
発現解析、ノックダウン、遺伝子導入... タンパク質の機能解析に至る具体的方法・手技を徹底解説。各方法の比較だけでなく、実験のプロによるコツ、さらには実験デザインまで。実験の見通しがグンとよくなる!
で作製したウイルス結合プレートの溶液を除去し、速やかに細胞懸濁液を加える。 標的細胞とウイルスベクターの接触を促す目的で、細胞添加後、遠心操作を行っても良い。例えば500× g 、1分間遠心など。 37℃、5% CO 2 インキュベーターで培養する。 Lentiviral High Titer Packaging Mix with pLVSINシリーズ
今回も実験 プロトコール です。 この目的は、自分の頭の整理・知識の確認の他に、いわゆる「おばあちゃんの知恵袋」的な、文献や教科書に載っていないけど知ってるとちょっと役立つようなことを記録しておくことです。 正確性には注意を払っておりますが、利用の際はご注意ください。 レンチウイルス関連の記事は以下の通り↓ レンチウイルスベクターの保存方法【短期保存】 - こりんの基礎医学研究日記 レンチウイルスベクターの保存方法 - こりんの基礎医学研究日記 【実験プロトコール】ウイルスタイターチェック - こりんの基礎医学研究日記 以下の プロトコール をもとに、ラボの先輩に教えてもらった方法です↓ 直径10㎝ディッシュを用意し、Poly-L-Lysineコーティングする。 ※Poly-L-Lysine(PLL)とは? 細胞膜上の陰イオンと培養容器表面上の 陽イオン との間の相互作用を促進する。つまりプラスチックやガラス面への細胞接着を促進する効果がある。 →省略してもあまり実験に影響ない印象 <やり方> 0.
A1 三好博士によると、約8kbまで挿入できることを確認していますが、インサートが大きいとtiterは落ちます。他のグループの論文 (Hum Gene Ther 12: 1893-1905, 2001) では16kbくらいの大きさまで入るという報告がありますが、やはりtiterは落ちるようです。 また、ベクタープラスミドのサイズが大きいため、サブクローニングが難しいかと思いますので、Gatewayのベクターのご使用をお勧めいたします。 Q2 Transfectionの時、CO 2 インキュベーターを3%にするのはなぜ? 組換えレンチウイルスを用いた標的細胞への遺伝子導入（トランスダクション）例：Protocols｜タカラバイオ株式会社. A2 リン酸カルシウム法に関しましては、Mol Cell Biol 7: 2745-2752 (1987)を読んでいただければ詳しく出ています。10%と5%ではtransfectionの効率に大きな差がありますが、5%と3%では3%の方が多少よい程度です。インキュベーターに余裕あれば3%をお勧めします。 Lipofectamineなどのリポソーム法でも問題はありませんが、 リン酸カルシウム法で293Tに100%入りますので、安くて経済的です。 Q3 Transfectionの際、Forskolinの役割は? A3 Forskolinはadenylate cyclaseを活性化してcAMPが増加しPKAを活性化することにより、間接的にCMVプロモーターに働き、CMVプロモーターの転写活性をあげます。多くのプラスミド(特にベクター)はCMVプロモーターでドライブしていますので、Forskolinを加えることによりtiterが上がります。 Q4 cPPTとは? A4 レトロウイルスは逆転写の際、3'LTRの直上流にあるPPT(polypurine tract)配列からプラス鎖の合成が始まるが、HIV-1にはゲノムの中央部分にcPPT(central polypurine tract)と呼ばれる同じ配列がもう一カ所あり、ここからも合成が行われるため、最終的な二本鎖cDNAには中央にDNAフラップと呼ばれる約100塩基対の3本鎖構造ができる。cPPT配列は逆転写の効率に影響を与えることが示唆されており、cPPT配列をベクターに組み込むことにより、遺伝子導入効率が高くなるといわれています。 Q5 WPREの役割は? A5 WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)は、mRNAの核から細胞質への能動的な輸送と細胞質でのmRNAの安定性を高める役割があるとされています。この配列をベクターに組み込むことにより、titerおよび導入遺伝子の発現効率が上がることが報告されています。 Q6 SINベクターとは?
A10 VenusはEYFPのVariantで、理研BSIの宮脇敦史先生により開発されました(Nat Biotechnol 20: 87-90, 2002)。細胞にもよりますが、VenusはEGFPやEYFPよりも数倍から10倍くらい明るく、蛍光顕微鏡やFACSではEGFPと全く同様に扱えます。IRESベクターでは、IRESの下流の遺伝子の発現がかなり低くなりますので、Venusを使用することをお勧めします。 Q11 導入遺伝子の発現レベルが低いのですが。 A11 レンチウイルスベクターでは、組み込んだ遺伝子の発現に内部プロモーターを使用するので、標的細胞において高発現のプロモーターを内部プロモーターとして使用することが重要です。CMV、EF-1α、UbC、CAGプロモーター等での比較や、組織特異的なプロモーターの使用をご検討下さい。 また、遺伝子導入効率が悪い場合には、細胞毒性のでない範囲でMOI(multiplicity of infection)を上げて下さい。 Q12 レンチウイルスベクターによるsiRNAの発現レベルは? A12 レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターもそうですが、single integrationですので、発現量があまり高くないのが問題となります(H1またはU6 promoter)。したがって、endogenousのtarget geneの発現量が多い場合には、ノックダウンの効果が弱くなります。MOIを上げてmultiple integrationにすることによりある程度解決しますが、やはり発現プラスミドのtransient transfectionに比べると弱いようです。また、3'LTRにsiRNA発現unitを挿入したベクター(コピー数が2になります)でも、基本的にあまり効果は変わりません。いずれにしても、よく利くtarget siteを選ぶことは重要です。 Q13 マクロファージへの遺伝子導入効率が悪い A13 第3世代packaging plasmidでは、vpr欠損のため、マクロファージへの遺伝子導入効率が他の細胞と比べて1桁近く下がります。vprを含むすべてのaccessory geneの入ったpackaging plasmidを使用するか、MOIを上げることにより解決されると思います。また、マクロファージで高発現のプロモーターを内部プロモーターとして使用することも重要です。 (MAN0034j) 2021.
2021年06月06日 カテゴリー: ラノベネタ・雑談 コメント(11) ほんまに素直に楽しめんくなるからやめろ 普通に主人公してるんだよなぁ... じゃあこんなとこいるなよ 影響受けたキッズが各所でキリトの名前使って暴れてるからだぞ >>8 影響受けたキッズ(おっさん) >>8 モンハンでもやらかしてたな キリトがつまらなくしてるよな えーとアインクラッド編はアニメ史上最高の評価なんですがそれは... (唖然) 現実にあてはめるとEスポーツの選手が同じゲームやってる女にモテてる話やね 1000: オススメの人気記事 家族ごっこがね…(笑) >>15 ん?あれは実際に家庭持つと共感できるんだよなぁ... w 1期の1クール目は面白かったけど2クール目の妖精のやつクッソつまらんくね >>16 一番面白いところなんだよなぁ >>23 原作3巻読んでないから分からんのやがキリトのチートステは原因判明しとるんか? RMT価格比較ランキング|rmt業者 買取 評判 | カカラン. >>213 ALOはSAOコピーしただけの代物だから 一部ステータスが引き継がれる 現実的かはともかくそういう話 小説のキリトくん好き アニメのキリト好きじゃない >>19 わかる 小説の方が内省的でいい あの家族ごっこ面白いか? キツ過ぎるわ 妹編は好き 前半は嫌い デスガンの後らへんはつまんね >>25 GGO編は持ち上げられすぎやろ 銃弾を斬るのは無理があるやろ... ってなったわ キリト 「10秒あたり400ってとこか?それがあんたら7人が俺に与えるダメージの総量だ」 ワイ「かっけぇ... (ビクンビクン」 >>26 デスゲームに置かれてる状況やし多少はそうなっても仕方ない >>26 お陰で他のゲームの不細工リジェネタンクどももキリト君ってあだ名になったんだよな 家族おるやつがこんなアニメ見て喜んどるんか?終わっとんなこの国. hackのパクリやろ? 再放送誰も実況してないのが闇深い 家族ごっこの所とビーターのとこがくさいぐらいで普通に名作 一期だけ見たけどもういいやってなったわ MMOよりもFPSの方をやってたからGGOの方がすきやわ 典型的なろうと同一視されるのほんまに納得行かんわ お兄様もいつのまにかなろうの代表として扱われてるの納得いかん >>39 うるせーなバカ >>39 むしろなろうよりもご都合がいいだろこの作品 主人公のためのレアスキルに違うゲームをプレイするのに昔のゲームの所持金とかを引き継げる 主人公を中心に世界が回っとるんか?
』 レン 「 はい! 」 アロウ 『 道を拓くぜ! 』 カイ 『 覇道天弓 』 「 この不良品と不埒者どもがぁー! 」 「 バカな! 」 @wantarou_Aniga 遂にルドルフの余裕が崩れたな 2021/06/12 00:21:26 『 前進いっぱーい! 』 『 任せろ! 』 『 行きましょう!これが唯一の神への道! 』 「 どうした神の使いとやら!スキだらけだぞ! 」 「 なんということか…ならば… 」 @c_wasa ここまで好き放題やってきたルドルフが狼狽えてるのスカッとするなぁ 2021/06/12 00:21:50 「 君たちとこの世界はこのルドルフ・コンダクトーレの手で滅ぼすしかないな 」 「 お手伝いいたします。ルドルフ様 」 カイ 『 ここは 』 シュウ 『 破滅のロンドの発射施設みたいだね。うまくいってよかったよ 』 ビット 「 博打だったのかよ 」 シュウ 『 さすがにこの戦いは想定外の連続だからね 』 カイ 『 新しいのが打ち込まれるぞ 』 「 面倒だ。施設ごと全部破壊しちまおうぜ 」 『 でも…これを壊したらリンガリンドに帰れなくなるんじゃ 』 『 ラクホウシステムがあるから…そっちを解析すれば、リンガリンドへの突入はできるよ 』 アロウ 『 じゃあ、遠慮はいらねぇな! 』 カイ 『 おう! 』 @nozo_subechan オールレンジ攻撃はやはり最強 2021/06/12 00:22:38 『 これは…神の世界か 』 『 そうだよ。君が出たがっていた壁の外だ 』 『 リンガリンドも…この中のひとつなの? 』 シュウ 『 あぁ…あそこが僕たちの故郷、リンガリンドだ 』 アタリー 『 あれが 』 『 そして…これが聖域だ。あの壁を破壊して中に侵入する 』 『 そこに神がいるはずだ 』 「 いよいよご対面か! 」 『 えぇ。そして説得を 』 『 それが無理なら倒す 』 「 いずれにしろ、中に入るのが先だね 」 カイ 『 ということだな 』 カイ 『 何が起きた 』 アタリー 『 人? 』 エルシャ 『 あの…顔は 』 「 去れ。ここはリンドの民が来るべきところではない 」 @ten_dai ナレーションがラスボス!!??? 2021/06/12 00:23:53 @nozo_subechan 武内氏、そういうことだったのか!! 2021/06/12 00:23:57 「 変質した信念や自我を神の領域に広げるな 」 『 なるほどな… 』 『 最後の敵は、俺ってわけか 』 @asashiba うわあああああ最後の敵が自分とか胸熱すぎる!