今回も実験 プロトコール です。 この目的は、自分の頭の整理・知識の確認の他に、いわゆる「おばあちゃんの知恵袋」的な、文献や教科書に載っていないけど知ってるとちょっと役立つようなことを記録しておくことです。 正確性には注意を払っておりますが、利用の際はご注意ください。 レンチウイルス関連の記事は以下の通り↓ レンチウイルスベクターの保存方法【短期保存】 - こりんの基礎医学研究日記 レンチウイルスベクターの保存方法 - こりんの基礎医学研究日記 【実験プロトコール】ウイルスタイターチェック - こりんの基礎医学研究日記 以下の プロトコール をもとに、ラボの先輩に教えてもらった方法です↓ 直径10㎝ディッシュを用意し、Poly-L-Lysineコーティングする。 ※Poly-L-Lysine(PLL)とは? 細胞膜上の陰イオンと培養容器表面上の 陽イオン との間の相互作用を促進する。つまりプラスチックやガラス面への細胞接着を促進する効果がある。 →省略してもあまり実験に影響ない印象 <やり方> 0.
A1 三好博士によると、約8kbまで挿入できることを確認していますが、インサートが大きいとtiterは落ちます。他のグループの論文 (Hum Gene Ther 12: 1893-1905, 2001) では16kbくらいの大きさまで入るという報告がありますが、やはりtiterは落ちるようです。 また、ベクタープラスミドのサイズが大きいため、サブクローニングが難しいかと思いますので、Gatewayのベクターのご使用をお勧めいたします。 Q2 Transfectionの時、CO 2 インキュベーターを3%にするのはなぜ? A2 リン酸カルシウム法に関しましては、Mol Cell Biol 7: 2745-2752 (1987)を読んでいただければ詳しく出ています。10%と5%ではtransfectionの効率に大きな差がありますが、5%と3%では3%の方が多少よい程度です。インキュベーターに余裕あれば3%をお勧めします。 Lipofectamineなどのリポソーム法でも問題はありませんが、 リン酸カルシウム法で293Tに100%入りますので、安くて経済的です。 Q3 Transfectionの際、Forskolinの役割は? A3 Forskolinはadenylate cyclaseを活性化してcAMPが増加しPKAを活性化することにより、間接的にCMVプロモーターに働き、CMVプロモーターの転写活性をあげます。多くのプラスミド(特にベクター)はCMVプロモーターでドライブしていますので、Forskolinを加えることによりtiterが上がります。 Q4 cPPTとは? レンチウイルス作製サービス | ベクタービルダー. A4 レトロウイルスは逆転写の際、3'LTRの直上流にあるPPT(polypurine tract)配列からプラス鎖の合成が始まるが、HIV-1にはゲノムの中央部分にcPPT(central polypurine tract)と呼ばれる同じ配列がもう一カ所あり、ここからも合成が行われるため、最終的な二本鎖cDNAには中央にDNAフラップと呼ばれる約100塩基対の3本鎖構造ができる。cPPT配列は逆転写の効率に影響を与えることが示唆されており、cPPT配列をベクターに組み込むことにより、遺伝子導入効率が高くなるといわれています。 Q5 WPREの役割は? A5 WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)は、mRNAの核から細胞質への能動的な輸送と細胞質でのmRNAの安定性を高める役割があるとされています。この配列をベクターに組み込むことにより、titerおよび導入遺伝子の発現効率が上がることが報告されています。 Q6 SINベクターとは?
A6 SIN( s elf in activating)ベクターは、3'LTRのU3にあるエンハンサー/プロモーター領域を削除してあります。ベクターRNAは細胞に感染後、逆転写の過程で3'LTRのU3が5'LTRのU3にコピーされるので、SINベクターの場合、染色体に組み込まれるベクターDNAのLTRは両方ともプロモーター活性を持たないことになり、安全性の高いベクターとなっています。詳しい説明は、「 レンチウイルスベクターについて 」を参照してください。 Q7 パッケージング細胞はないのか? A7 パッケージング細胞はありますが、pol遺伝子にコードされているプロテアーゼやVSV-Gの発現が細胞にとって毒性が高いので、これらの遺伝子がベクターを産生させる時だけ発現するようにtet inducible systemを使っています。しかし、通常のラボでの解析目的に使用する量のベクターを得るためには、その扱いが煩雑すぎるのであまりお勧めしておりません。同じベクターが大量に必要な場合には、パッケージング細胞にVector plasmidをtransfectionしてstable lineを樹立した方がよい場合もあります。 Q8 ベクタープラスミドにはZeocin耐性遺伝子が組込まれていますが、細胞にウイルスを感染させた後のtransformantのselectionに使用可能でしょうか? A8 Zeocin耐性遺伝子はLTRの外側にありますのでウイルスゲノムには含まれません。従いまして、ウイルス感染細胞をZeocinでselectionすることはできません。大腸菌でのselectionまたはプラスミドをパッケージング細胞にtransfectionしてstable transformantをとるためのselectionに使用します。 Q9 超遠心以外でウイルスを濃縮する方法はないのか?
発現解析、ノックダウン、遺伝子導入... タンパク質の機能解析に至る具体的方法・手技を徹底解説。各方法の比較だけでなく、実験のプロによるコツ、さらには実験デザインまで。実験の見通しがグンとよくなる!
カチオン性ポリマー。比較的安価なトランスフェクション試薬。 もともと、 24μlと現在の半分の量で最初は教えてもらいました。 しかしウイルスタイターが悪く、 2倍にしてみたところ、タイターがよくなったような気がした ため、それ以降は48μlでやっております。 ※その他レンチウイルス作成に必要なもの ①パッケージングプラスミド(今回はpCAG-HIVgp) ② エンベロープ 糖タンパク質をコードするプラスミド (VSV-G=水疱性 口内炎 ウイルスなど 今回もVSV-G) ③目的のプラスミド(SIN=Self inactivating ベクター プラスミド) 上記混合液を室温で15-20分放置。 混合液を ピペット マンでぴペッティングした後に、ディッシュに均一に播く。 37℃インキュベーション 48時間 ウイルス含有培養上清を50mlシリンジなどで回収。0. 45μmフィルターを通して別シリンジへ。 必要に応じて保存or遠心濃縮。 最初にウイルスを作成したときはとてもタイターが低かったのですが、なぜか繰り返しているうちに、だんだんと安定したタイターが得られるようになってきたような気がします。ウイルスタイターについてはまたどこかで書きたいと思っています。 今回は以上です。
ボックス内に貼ってあります。 原付ギア車のコードラベルの位置 ギア車はフレームのどこかに貼ってあります。 大抵は シートを外したあたりにあることが多いです。 HONDAエイプの場合はシートを外します 赤丸のシート固定ボルトを外します。 シート固定ボルトは12mmサイズで左右2本付いています。 シートが外れました。赤丸の位置に何かあります! ここです!ラベルが貼ってあります! ありました!このエイプは2009年だとわかります。 以上がホンダの年式の調べ方でした。 是非参考にして自分の愛車が何年式かを調べて見てください。 原付ライダーに役立つ情報配信中! Twitterで簡単メンテ法やハウツー動画など配信中! バイクの年式や初年度登録とは?調べ方や検索時の注意点|口下手でもバイクを楽に高く売る!元バイク屋こたろーが教えます。. Tweets by Bike_50_125 原付ライダー宛てのお役立ちツイートなので気軽にフォローお願いします! Follow @Bike_50_125 YAMAHA車の年式を知る方法 次はヤマハ原付の年式を調べる方法をご紹介します。 ホンダとは違うやり方になりますので要チェックです。 まずは車台番号を調べる ホンダ以外の3社は車台番号を元に年式を調べる方法になります。 車台番号とは・・・ バイク一台づつに必ずある番号で車体のどこかに刻印されています。 別名"フレームナンバー"とも言います。 車台番号は書類を見るのが手っ取り早い 車台番号はナンバーの書類や自賠責保険証明書に必ず記載されています。 車体の刻印を見てもいいのですが書類を見るのが早いです。 自賠責保険の書類を用意して確認してください。 車台番号がわかりますのでメモを取っておきましょう! 書類が無いときは車体の刻印を見て! 自賠責の書類等が見当たらない時は車体から番号を知る方法があります。 車台番号は必ず車体のどこかに刻印されています。 それを見つけて車台番号をメモしてください。 刻印が見つからない人はこちらをチェック ↓ 原付バイク車台番号の位置 50cc~125cc車種別の刻印場所 ヤマハの公式サイトでわかる! 車台番号をメモしましたね? あとはヤマハの公式サイトに車台番号を入力するだけで年式がわかってしまいます! ヤマハ部品情報検索 こちらはヤマハの部品検索用のページになるのですが車台番号を打ち込むと年式も表示されて大変便利なサービスです。 是非使ってみてください。 サイトの使い方 スマートフォン版とパソコン版で分かれているのでそれぞれ画面に沿って進んでください。 すると【車台番号検索】がでてきますので そこにメモした車台番号を打ち込むと年式が表示されます。 非常に簡単なのでやってみてください!
ダメろー 自分のバイク、、何年式だっけ? こたろー 実はバイク屋でよく聞く話だったりします。 ダメろー 自分のバイクの年式を忘れてしまったよ。 そういった方向けにバイクの年式の調べ方をまとめました。 自分のバイクの年式を調べたい方、必見の記事です。 バイクの年式とは?
WEBサイトの「部品情報検索」をご利用いただき、車台番号を入力いただくことによりモデル年度、販売開始年月をご確認いただけます。 ※一部機種によっては表示しない場合がございます。 ⇒ 部品情報検索はこちら なお、「部品情報検索」は1990年生産以降の掲載が可能なモデル・機種のデータのみ掲載しています。掲載の無いモデル・機種につきましては、最寄のヤマハモーターサイクル取扱店までお問い合せください。 ⇒ 販売店検索はこちら