ここで示したのはほんの一例であり,相関解析の全データ,それぞれの遺伝子情報の全データは原著論文のSupporting Online Materialに掲載しているので,参考にしてほしい. おわりに この研究で構築した単一分子・単一細胞プロファイリング技術は,複雑な細胞システムを素子である1分子レベルから理解することを可能とするものであり,1分子・1細胞生物学とシステム生物学とをつなぐ架け橋となりうる.以下,従来のプロファイリングの手法と比べた場合のアドバンテージをまとめる. 1)単一細胞内における遺伝子発現の絶対個数がわかる. 2)細胞を生きたまま解析でき,リアルタイムでの解析が可能. 3)細胞ごとの遺伝子発現量の確率論的なばらつきを解析できる. 4)ごくわずかな割合で存在する異常細胞を発見できる. 5)シグナル増幅が不要であり,遺伝子によるバイアスがきわめて少ない. 6)単一細胞内での2遺伝子の相互作用解析が可能. 7)細胞内におけるタンパク質局在を決定できる. これらのアドバンテージを利用することで,細胞ひとつひとつの分子数や細胞状態の違いを絶対感度でとらえることが可能となり,さまざまな生命現象をより精密に調べることが可能となる.この研究では,生物特有の性質である個体レベルでの生命活動の"乱雑さ"を直接とらえることを目的としてこの技術を利用し,その一般原理のひとつを明らかにしている. この研究で得られた大腸菌の単一分子・単一細胞プロファイルは,分子・細胞相互の階層から生物をシステムとして理解するための包括的データリソースとして役立つとともに,生物のもつ乱雑性,多様性を理解するためのひとつの基礎になるものと期待される. 文 献 Yu, J., Xiao, J., Ren, X. et al. : Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time. Science, 311, 1600-1603 (2006)[ PubMed] Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M. : Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. 遺伝子実験機器 : シングルセル解析プラットフォーム ChromiumTM Controller | 株式会社薬研社 YAKUKENSHA CO.,LTD.. Cell, 123, 1025-1036 (2005)[ PubMed] Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D. : Stochastic gene expression in a single cell.
2.ハイスループット解析用のマイクロ流路系の開発 膨大な数のライブラリー株をレーザー顕微鏡によりハイスループットで解析するため,ソフトリソグラフィー技術を用いてシリコン成型したマイクロ流体チップを開発した 6) ( 図1b ).このチップは平行に並んだ96のサンプル流路により構成されており,マルチチャネルピペッターを用いてそれぞれに異なるライブラリー株を注入することによって,96のライブラリー株を並列的に2次元配列することができる.チップの底面は薄型カバーガラスになっているためレーザー顕微鏡による高開口数での観察が可能であり,3次元電動ステージを用いてスキャンすることにより多サンプル連続解析が可能となった.チップの3次元スキャン,自動フォーカス,光路の切替え,画像撮影,画像分析など,解析の一連の流れをコンピューターで完全自動化することにより,それぞれのライブラリー株あたり,25秒間に平均4000個の細胞の解析を行うことができた. 3.タンパク質発現数の全ゲノム分布 解析により得られるライブラリー株の位相差像と蛍光像の代表例を表す( 図1c ).それぞれの細胞におけるタンパク質発現量が蛍光量として検出できると同時に,タンパク質の細胞内局在(膜局在,細胞質局在,DNA局在など)を観察することができた.それぞれの細胞に内在している蛍光に対して単一蛍光分子による規格化を行い,さらに,細胞の自家蛍光による影響を差し引くことによって,それぞれの細胞におけるタンパク質発現数の分布を決定した( 図1d ).同時に,画像解析によって蛍光分子の細胞内局在(細胞質局在と細胞膜局在との比,点状の局在)をスコア化した( 図1e ). この結果,大腸菌のそれぞれの遺伝子の1細胞あたりの平均発現量は,10 -1 個/細胞から10 4 個/細胞まで,5オーダーにわたって幅広く分布していることがわかった.必須遺伝子の大半が10個/細胞以上の高い発現レベルを示したのに対し,全体ではおおよそ半数の遺伝子が10個/細胞以下の発現レベルを示した.低発現を示すタンパク質のなかには実際に機能していることが示されているものも多く存在しており,これらのタンパク質は10個以下の低分子数でも細胞内で十分に機能することがわかった.このことは,単一細胞レベルの微生物学において,単一分子感度の実験が本質的でありうることを示唆する.
8.mRNAプロファイリング つぎに,タンパク質発現の中間産物であるmRNAの量を単一分子感度・単一細胞分解能でプロファイリングすることを試みた.そのために,蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)法を用いて,ライブラリーの黄色蛍光タンパク質のmRNAに赤色蛍光ヌクレオチドを選択的にハイブリダイゼーションした.この方法ではすべてのライブラリーに対して同じプローブを用いるため,遺伝子ごとのバイアスがほとんどない.レーザー顕微鏡を用いて細胞内の蛍光ヌクレオチドを数えることにより,mRNA数の決定を行った. mRNA数のノイズを調べた結果,タンパク質の場合とは異なり,ポアソンノイズにもとづくノイズ極限だけがみられた.これは,mRNAの数は少ないためにポアソンノイズが大きくなり,一様なノイズ極限の影響が現われなくなったためであると考えられた. 9.mRNAレベルとタンパク質レベルとの非相関性 赤色蛍光ヌクレオチドと黄色蛍光タンパク質の蛍光スペクトルが異なることを利用して,単一細胞におけるmRNA数とタンパク質数を同時に測定しその相関を調べた.137の遺伝子に対して測定を行ったところ,どの遺伝子においてもこれらのあいだには強い相関はなかった.つまり,単一細胞においては内在するmRNA数とタンパク質数とのあいだには相関のないことが判明した. この非相関性のおもな理由としてmRNAの分解時間の速さがあげられる.RNA-seq法を用いてmRNAの分解時定数を調べたところ,数分以下であった.これに対し,ほとんどのタンパク質の分解時定数は数時間以上であり,タンパク質数の減衰はおもに細胞分裂による希釈効果により起こることが知られている 9) .したがって,mRNAの数は数分以内に起こった現象を反映するのに対し,タンパク質の数は細胞分裂の時間スケール(150分)のあいだで積み重なった現象を反映することになり,これらの数のあいだに不一致が起こるものと考えられる. 単一細胞におけるmRNA量の高ノイズ性を示す今回の結果は,1細胞レベルでのトランスクリプトーム解析に対してひとつの警告をあたえるものであり,同時に,プロテオーム解析の必要性を表している. 10.1分子・1細胞レベルでの発現特性と生物学的機能との相関 得られた1分子・1細胞レベルでの発現特性が生物学的な機能とどのように相関しているかを統計的に調べた.たとえば,タンパク質発現平均数はコドン使用頻度の指標であるCAI(codon adaptation index)と正の相関をもつのに対し,GC含量やmRNAの分解時間,染色体上の位置との相関はなかった.また,膜トランスポーターの遺伝子は高い膜局在性,転写因子は高い点局在性を示した.また,短い遺伝子は高いタンパク質発現を示すことや,リーディング鎖にある遺伝子からの転写はラギング鎖にある遺伝子からの転写よりも多いことがわかった.さらに,大腸菌のノイズは出芽酵母のノイズと比べ高いことも明らかになった 10) .
4.タンパク質数分布の普遍的な構造 それぞれの細胞におけるタンパク質数の分布を調べたところ,一般に,低発現数を示すタンパク質の分布は単調減少関数,高発現数を示すタンパク質の分布はピークをもった関数になっていた.さまざまなモデルを用いてフィッティングを行い,すべての遺伝子の分布を一般的に記述できる最良の関数を探した結果,1018遺伝子のうち1009遺伝子をガンマ分布によって記述できることをみつけた.大腸菌はガンマ分布というゲノムに共通の構造にそってプロテオームの多様性を生み出しており,その分布はガンマ分布のもつ2つのパラメーターによって一般的に記述できることが明らかになった. このガンマ分布は,mRNAの転写とタンパク質の翻訳,mRNAの分解とタンパク質の分解が,それぞれ確率的に起こると仮定した場合のタンパク質数の分布に等しい 7) ( 図2 ).これはつまり,タンパク質数の分布がセントラルドグマの過程の確率的な特性により決定づけられることを示唆している.そこで以降,このガンマ分布を軸として,細胞のタンパク質量を正しく記述するためのモデルをさらに検証した. 5.タンパク質数のノイズの極限 タンパク質数の分布のばらつきの大きさ,または,ノイズ(発現数の標準偏差の2乗と発現数の平均の2乗の比と定義される)は,個々の細胞におけるタンパク質量の多様性を表す重要なパラメーターである 3) .このノイズをそれぞれの遺伝子について求めたところ,つぎに示すような発現量の大きさに応じた二相性のあることをみつけた. 平均発現数が10分子以下の遺伝子は,ほぼすべてがポアソンノイズを下限とする,発現数と反比例した量のノイズをもっていた.このポアソンノイズは一種の量子ノイズであり,遺伝子発現が純粋にランダムに(すなわち,ポアソン過程で)行われた場合のノイズ量を表している.つまり今回の結果は,タンパク質発現のノイズをポアソンノイズ以下に抑えるような遺伝子制御機構は存在しないことを示唆する.実際のノイズがポアソンノイズを上まわるということは,遺伝子の発現が準ランダムに行われていることを表している.実際,ひとつひとつのタンパク質の発現は純粋なランダムではなく,mRNAの発現とともに突発的に複数のタンパク質の発現(バースト)が起こり,mRNAの分解と同時にタンパク質の発現がとまる,といったかたちでバースト的に行われることが報告されている 1) .筆者らは,複数のライブラリー株をリアルタイム計測することでバーストの観測を行うことにより,バーストの頻度と大きさが細胞集団計測で得られるノイズの大きさに合致することをみつけた.これはつまり,ノイズの大きさがmRNAバーストの性質により決定されていることを表している.
5ml 3. 0ml 3. 0ml 2. 0ml バッテリー 650mAh 650mAh 650mAh 650mAh 電圧 3. 7V 可変電圧式3. 3V、 3. 8V、4. 3V、4. 8V 可変電圧式3. 8V 4.
VAPEは専用のリキッドを蒸気にして吸う仕組みであるため、液漏れのトラブルが発生することがあります。 構造上、絶対に液漏れが起こらないようにするのは難しいですが、対策をとることでトラブルの発生を最小限に抑えることが可能です。 今回はVAPEの構造と仕組みをおさらいしながら、液漏れの原因や対策方法について詳しく解説します。また、液漏れしにくい商品も紹介しますので、対策が面倒な人はぜひ参考にしてください。 PEの仕組み・構造を理解し液漏れの原因を探る 液漏れが起こる原因を把握すれば、おのずと対策方法も見えてきます。ほとんどの場合、液漏れトラブルは部品や構造に起因するので、VAPEの仕組みや各パーツの役割を理解することが重要です。ここでは、VAPEの主要パーツであるタンクとアトマイザー、コイルの構造や役割について紹介します。 1-1. タンク・アトマイザー 一般的なVAPEは、タンク内に入れたリキッドをアトマイザー内のコイルに巻いたコットンに染み込ませます。パフボタンを押しながら吸引すると、エアフローから空気が入ると同時にコイルがリキッドを加熱し、蒸気が発生する仕組みです。アトマイザーにはコイルユニットを交換するクリアロマイザーと、コイルを自分で巻いて調整するRBAがあります。クリアロマイザーの主流はタンク式ですが、RBAはタンク式でないものが多いです。アトマイザーは中のコイルやコットン、あるいはエアフローの空気量によって煙量やフレーバーが大きく変わるため、それぞれのVAPEを特徴づける最重要パーツといえます。 1-2. コイル クリアロマイザーを取り付けるタイプでもペンタイプでも、交換式のコイルが必須で、エアフローのついたアトマイザーベースに取り付けて使用します。コイルはバッテリーから供給される電気が流れている部分に接触し、コットンに染み込んだリキッドを加熱して気化させる、アトマイザーの核となる部品です。VAPEの構造上リキッドに直接作用するのはコイルしかないため、基本的に液漏れはコイル周りで発生します。したがって、コイルからの液漏れがないか常に意識しておくのが有効な対策です。VAPEを使用していると、エアフローなどさまざまな部位からリキッドが漏れる可能性がありますが、一見関係なさそうであっても、まずはコイルそのものや周辺パーツをチェックすることをおすすめします。 PEの箇所別液漏れの原因と対策 VAPEの液漏れが起こったとき、どこから漏れているのかを確認することで発生原因を突き止められます。原因を把握して適切な対策をとり、液漏れを防ぎましょう。ここでは、VAPEの液漏れ箇所に応じた、原因と対策を解説します。 2-1.
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ドリップチップ VAPEの構造上、吸い口であるドリップチップから液漏れする可能性は低いです。しかし、ドリップチップにリキッドが漏れ出てくる状態は起こりえます。それは、蒸気化したリキッドがアトマイザー内に残ってしまい、冷却されて液体に戻ったものがドリップチップから出てくるようなケースです。この場合は発生した蒸気をしっかり吸い切ることで対策できます。蒸気を吸い切るためにパフボタンから指を離すときに同時に口を離さず、少し長めに吸い続けてください。こうすれば気化したリキッドをアトマイザー内に残してしまうことを防げます。冬に外でVAPEを吸う場合などは、本体が冷えているとドリップチップ周りで蒸気が液体に戻りやすいので注意しましょう。 PEの状況別の液漏れの原因と対策 VAPEの液漏れが特定の状況下で起こっている場合は、原因を見極めやすく対策も取りやすいです。ほとんど喫煙中か持ち運び中に発生するので、それぞれの状況で考えられる原因と対策を以下に紹介します。 3-1. 喫煙中の液漏れ VAPEを喫煙しているとリキッドが漏れてきて嫌な思いをしたことがある人も多いでしょう。比較的よく起こることなのであまり気にしないという人もいるかもしれませんが、周りの人に不快感を与える音ですし、自分の手を汚すこともあるので対策しておきたいところです。喫煙中の液漏れは、エアフローを絞った状態でVAPEを連続吸いするときに発生しやすく、これはコイルのフィルター部に過剰にリキッドが集まって気化が追いつかなくなるのが原因だと考えられます。蒸気になりきれなかったリキッドがエアフロー部から漏れ出てくるわけですね。そのため、エアフローを開放し、連続吸いを避ければ簡単に解決できます。 しかし、VAPEのフレーバーやキック感が薄くなったり、吸い方の自由度が低くなったりするのを避けたい人もいるでしょう。それなら次の方法がおすすめです。液体がたまって音がし始め「漏れてきそうだ」と思ったら、エアフロー部をティッシュペーパーや柔らかい布で押さえて、電源を入れたままで吸い込んでください。音がしなくなるまで吸い込んだら、今度は思い切り息を吹き込みます。これでしばらく液漏れが起こらなくなるでしょう。もし一時的におさまっても何度も液漏れが発生するようなら、本体の故障やパーツ不良である可能性もわずかながらありますので、修理や買い替えも検討してみてください。 3-2.