発現解析、ノックダウン、遺伝子導入... タンパク質の機能解析に至る具体的方法・手技を徹底解説。各方法の比較だけでなく、実験のプロによるコツ、さらには実験デザインまで。実験の見通しがグンとよくなる!
A10 VenusはEYFPのVariantで、理研BSIの宮脇敦史先生により開発されました(Nat Biotechnol 20: 87-90, 2002)。細胞にもよりますが、VenusはEGFPやEYFPよりも数倍から10倍くらい明るく、蛍光顕微鏡やFACSではEGFPと全く同様に扱えます。IRESベクターでは、IRESの下流の遺伝子の発現がかなり低くなりますので、Venusを使用することをお勧めします。 Q11 導入遺伝子の発現レベルが低いのですが。 A11 レンチウイルスベクターでは、組み込んだ遺伝子の発現に内部プロモーターを使用するので、標的細胞において高発現のプロモーターを内部プロモーターとして使用することが重要です。CMV、EF-1α、UbC、CAGプロモーター等での比較や、組織特異的なプロモーターの使用をご検討下さい。 また、遺伝子導入効率が悪い場合には、細胞毒性のでない範囲でMOI(multiplicity of infection)を上げて下さい。 Q12 レンチウイルスベクターによるsiRNAの発現レベルは? A12 レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターもそうですが、single integrationですので、発現量があまり高くないのが問題となります(H1またはU6 promoter)。したがって、endogenousのtarget geneの発現量が多い場合には、ノックダウンの効果が弱くなります。MOIを上げてmultiple integrationにすることによりある程度解決しますが、やはり発現プラスミドのtransient transfectionに比べると弱いようです。また、3'LTRにsiRNA発現unitを挿入したベクター(コピー数が2になります)でも、基本的にあまり効果は変わりません。いずれにしても、よく利くtarget siteを選ぶことは重要です。 Q13 マクロファージへの遺伝子導入効率が悪い A13 第3世代packaging plasmidでは、vpr欠損のため、マクロファージへの遺伝子導入効率が他の細胞と比べて1桁近く下がります。vprを含むすべてのaccessory geneの入ったpackaging plasmidを使用するか、MOIを上げることにより解決されると思います。また、マクロファージで高発現のプロモーターを内部プロモーターとして使用することも重要です。 (MAN0034j) 2021.
レンチウイルス MMLV アデノウイルス AAV 指向性 広範 感染しない細胞がある 血清型に依る 非分裂動物細胞への感染 感染する 感染しない 安定発現または一過的発現 ゲノム挿入による安定発現 一過的発現、エピソーマル 最高タイターの相対的評価 高い 中程度 大変高い プロモーター選択の自由度 自由度あり 自由度なし 至適使用系 培養細胞とin vivo 培養細胞と in vivo In vivo 生体での免疫原性 低い 大変低い タイターの決定方法は? レンチウイルスタイターの測定にはp24ELISAを使用します。この方法では、サンドイッチイムノアッセイを使用して、レンチウイルス上清中のHIV-1p24コアタンパク質のレベルを測定します。レンチウイルスサンプルを最初にマイクロタイタープレートに加え、そのウェルを抗HIV-1 p24キャプチャー抗体でコーティングして、レンチウイルスサンプル中のp24に結合させます。これに続いて、ビオチン化抗p24二次抗体が添加され、プレート上の一次抗体によってキャプチャーされたp24に結合します。次に、ストレプトアビジンとビオチンの間の相互作用により、ビオチン化抗p24抗体を結合するためにストレプトアビジン-HRPコンジュゲートが追加されます。基質溶液が最終的にサンプルに追加され、HRPとの相互作用で発色します。 着色した生成物の強度は、各レンチウイルスサンプルに存在するp24の量に比例します。分光光度計を使用して強度を測定し、組換えHIV-1p24標準曲線と比較することによって正確に定量化されます。p24値は、対応するレンチウイルスサンプルのウイルスタイターと相関関係にあります。 VectorBuilderのウイルスタイター保証とは? プロトコールとＱ＆Ａ | 遺伝子材料開発室 (RIKEN BRC). 当社のタイター保証は、ウイルスにパッケージされている領域(Δ5'LTRからΔU3/ 3'LTRまで)がレンチウイルスの搭載制限(9. 2 kb)を下回っているベクターに適用されます。搭載制限を超えるサイズの場合でも、ベクターをウイルスにパッケージすることは可能かもしれませんが、タイターが低下する可能性があります。あまた、以下のベクターの場合、当社のタイター保証は適用できません: 毒性遺伝子(例:アポトーシス促進遺伝子)、パッケージング細胞またはウイルスの完全性を損なう遺伝子(例:細胞凝集を引き起こす膜タンパク質)などのパッケージングプロセスに悪影響を与える可能性のある配列を含むベクター、および欠失や二次構造を取りやすいい配列(例:反復配列または非常にGC含量が高いシーケンス); パッケージング効率に不確実性をもたらす可能性のある、非公開の配列または非定型レンチウイルス機能要素(LTRなど)を含むユーザー提供のプラスミドの場合。 製造作業日数は、プロジェクト開始から完了までの日数です。お客様から提供されたマテリアル(プラスミドDNAやウイルスベクターなど)が弊社製造拠点に到着するまでの待ち日数、マテリアルの品質検査にかかる日数、そして完成した納品物をお客様に発送するための輸送日数は含まれていません。
Lentivirus Vector レンチウイルスベクター レンチウイルスベクターについて レンチウイルスベクター Plasmidリスト プロトコールとQ&A プロトコール Lentiviral Vector Preparation (pdf) [ in English / in Japanese] Lentiviral Vector for RNAi (pdf) [ in English / in Japanese] Lentiviral Vector for Inducible RNAi (pdf) [ in English / in Japanese] Transduction of Human Hematopoietic Stem Cells (Miyoshi, H. Gene delivery to hematopoietic stem cells using lentiviral vectors. Methods Mol. Biol. 246:429-38, 2004. PMID: 14970608) レンチウイルスベクターQ&A (三好浩之博士による) レンチウイルスベクター全般に関しましては、以下の総説をご参考下さい。 三好浩之:レンチウイルスベクター 最新医学 幹細胞研究の最近の進歩(最新医学社)Vol. 64 (3月増刊号), 232-242 (2009). 三好浩之:レンチウイルスベクター バイオ医薬品の開発と品質・安全性確保(エル・アイ・シー), 612-625 (2007). 三好浩之:蛍光タンパク質遺伝子導入法 レンチウイルスベクターによる導入 バイオテクノロジージャーナル(羊土社)7, 97-105 (2007). 三好浩之:遺伝子導入法(レンチウイルスベクター) 実験医学(別冊) 免疫学的プロトコール(羊土社), 127-137 (2004). 三好浩之:レンチウイルスベクターを用いた造血幹細胞への遺伝子導入 ウイルス Vol. 52, 225-231 (2002). 【実験プロトコール】レンチウイルスベクターの作製方法 - こりんの基礎医学研究日記. 三好浩之:レンチウイルスベクターによる非分裂細胞への遺伝子導入 細胞工学(秀潤社) Vol. 20, 1234-1242 (2001). 作製方法については、まず日本語のプロトコールをご覧下さい。 レンチウイルスベクターの遺伝子組換え実験レベルについては、「 レンチウイルスベクターについて 」をご覧下さい。 Q1 ベクターに挿入できるインサートの大きさはどれくらいまででしょうか?
今回も実験 プロトコール です。 この目的は、自分の頭の整理・知識の確認の他に、いわゆる「おばあちゃんの知恵袋」的な、文献や教科書に載っていないけど知ってるとちょっと役立つようなことを記録しておくことです。 正確性には注意を払っておりますが、利用の際はご注意ください。 レンチウイルス関連の記事は以下の通り↓ レンチウイルスベクターの保存方法【短期保存】 - こりんの基礎医学研究日記 レンチウイルスベクターの保存方法 - こりんの基礎医学研究日記 【実験プロトコール】ウイルスタイターチェック - こりんの基礎医学研究日記 以下の プロトコール をもとに、ラボの先輩に教えてもらった方法です↓ 直径10㎝ディッシュを用意し、Poly-L-Lysineコーティングする。 ※Poly-L-Lysine(PLL)とは? 細胞膜上の陰イオンと培養容器表面上の 陽イオン との間の相互作用を促進する。つまりプラスチックやガラス面への細胞接着を促進する効果がある。 →省略してもあまり実験に影響ない印象 <やり方> 0.
A1 三好博士によると、約8kbまで挿入できることを確認していますが、インサートが大きいとtiterは落ちます。他のグループの論文 (Hum Gene Ther 12: 1893-1905, 2001) では16kbくらいの大きさまで入るという報告がありますが、やはりtiterは落ちるようです。 また、ベクタープラスミドのサイズが大きいため、サブクローニングが難しいかと思いますので、Gatewayのベクターのご使用をお勧めいたします。 Q2 Transfectionの時、CO 2 インキュベーターを3%にするのはなぜ? A2 リン酸カルシウム法に関しましては、Mol Cell Biol 7: 2745-2752 (1987)を読んでいただければ詳しく出ています。10%と5%ではtransfectionの効率に大きな差がありますが、5%と3%では3%の方が多少よい程度です。インキュベーターに余裕あれば3%をお勧めします。 Lipofectamineなどのリポソーム法でも問題はありませんが、 リン酸カルシウム法で293Tに100%入りますので、安くて経済的です。 Q3 Transfectionの際、Forskolinの役割は? A3 Forskolinはadenylate cyclaseを活性化してcAMPが増加しPKAを活性化することにより、間接的にCMVプロモーターに働き、CMVプロモーターの転写活性をあげます。多くのプラスミド(特にベクター)はCMVプロモーターでドライブしていますので、Forskolinを加えることによりtiterが上がります。 Q4 cPPTとは? A4 レトロウイルスは逆転写の際、3'LTRの直上流にあるPPT(polypurine tract)配列からプラス鎖の合成が始まるが、HIV-1にはゲノムの中央部分にcPPT(central polypurine tract)と呼ばれる同じ配列がもう一カ所あり、ここからも合成が行われるため、最終的な二本鎖cDNAには中央にDNAフラップと呼ばれる約100塩基対の3本鎖構造ができる。cPPT配列は逆転写の効率に影響を与えることが示唆されており、cPPT配列をベクターに組み込むことにより、遺伝子導入効率が高くなるといわれています。 Q5 WPREの役割は? A5 WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)は、mRNAの核から細胞質への能動的な輸送と細胞質でのmRNAの安定性を高める役割があるとされています。この配列をベクターに組み込むことにより、titerおよび導入遺伝子の発現効率が上がることが報告されています。 Q6 SINベクターとは?
1. 一時金タイプ 一時金タイプは、がんと診断されたら「100万円」などのまとまったお金を受け取れるものです。受け取ったお金をどのようなことに使ってもかまいません。 入院費用でも、手術費用でも、民間療法でも、極端なことを言えば旅行の費用でも、何に使っても全く問題ありません。 最も汎用性が高いタイプ です。 1. 2. 治療ごと受取タイプ 治療ごと受取タイプは、入院・通院に関わらず受ける可能性が高い治療について、受けるごとに決まった額を受け取れるものです。 治療が長期間続くケースに有効 です。 1. 3. 貯蓄型保険で一括払いできる3つのタイプ | 保険の教科書. 「●歳まで払い」より「終身払い・保険料払込免除特約付」がおすすめ 終身・掛け捨て型のがん保険では、保険料の払込期間を「60歳まで」「65歳まで」などと決めることができます。 加入中ずっと支払い続ける「終身払い」よりも、1ヶ月あたり、1年あたりの保険料は高くなります。その代わり、払込期間後は一生涯にわたり、保険料の負担なく保障を受けることができるのです。 しかし、この「●歳まで払い」は、一般的にはあまりおすすめしません。なぜなら、がん保険の見直しが困難になるからです。 というのは、先ほどもお伝えしたように、20年前と今とではがんの治療が大きく変わっています。 「一時金タイプ」であれば、どんな治療を受けても使えるので「●歳まで払い」を選んでも良いかもしれません。しかし、それ以外のタイプを選ぶ場合は、がん治療の進歩とともに保障内容が古くなる可能性がありますので、「●歳まで払い」あまりおすすめできません。 おすすめなのは、 「終身払い」を選択した上で、がんと診断された時に保険料が免除される特約(保険料免除特約)を付ける ことです。 2. 終身・貯蓄型がん保険|保険料は掛け捨て型の数倍 終身・貯蓄型がん保険の現在の主流は、「70歳」など 一定の年齢まで加入し続けると、それまで支払った保険料全額が還付金として戻ってくるもの です。 なお、その年齢までの間にがんにかかって保険金を受け取っていた場合、その分の額は差し引かれます。 保険料の額は一生涯変わりません。しかし、掛け捨て型がん保険の数倍とかなり割高になります。 しかも、還付金を受け取った後も保険に加入し続けたければ、その割高の保険料を支払い続ける必要があります。 そのため、以下の2つを心に留めておく必要があります。 保険料が全額返ってくるには一定の年齢まで加入し続けなければならない 一生涯の保障を得たければ割高な保険料をずっと支払い続けなければならない 加入するならば、これらのことについて十分に理解し、納得した上でする必要があります。 3.
7%です。払込保険料は、総額で約780万円。65歳のときに解約すると、解約返戻金が約810万円です。つまり、「その間、実質的な保険料の負担がなく保障が受けられるし、おカネまで貯まるのでお得」であると、そういうことですか?
実は、担当者は 相談所によって異なり 、担当者全員がFPをはじめとする資格を所持しているとは限りません。 FP(ファイナンシャルプランナー)とは FPとは、以下のような幅広い知識を持ち合わせている者を指します。 保険 教育資金 年金制度 家計にかかわる金融 不動産 住宅ローン 税制など 生命保険への新規加入や見直しも、家計や家族のお金に直結する項目であることから、専門知識を有している担当者のほうが、 有益な提案やアドバイス ができる可能性が高くなります。 無料の保険相談所のメリットの1つとして、 複数の保険会社の商品を比較・検討できる という点が挙げられます。 ということは、比較できる対象が多いほうが自分や家族に より最適な商品が見つかりやすい ということですね!
ご紹介したように掛け捨て型のガン保険は、割安な保険料でガンに対する保障を持つことができますが、解約した場合に受取れるお金はほとんどありません。一方の貯蓄型のガン保険は、ガンに対する保障と貯蓄を同時に持つことが出来ますが、掛け捨て型に比べて保険料は割高になります。それぞれ特長に大きな違いはありますが、どちらも万が一ガンになった際のリスクに備えるという点は同じです。 ガンになるリスクは人によって異なりますし、どのような保障を受けたいのか、その保障に対してどのくらいの保険料なら負担できるのか、といったことも人によって異なります。掛け捨て型と貯蓄型のそれぞれの特長とメリット・デメリットをしっかり理解したうえで、ご自身に合ったガン保険を選びましょう。
コツコツ保険料を支払ってお金を貯めるタイプ 毎月などでいくらかの保険料を支払うタイプの保険商品です。 こちらは死亡保障がついていない投資のみを目的とした個人年金タイプと、死亡保障がつく終身保険のタイプがあります。 なお両者を比較すると、終身保険には死亡保障がある分だけ、貯蓄性でみると個人年金保険の方が高くなっています。 以下、それぞれのタイプを紹介します。 2-1. 死亡保障がなく実質貯蓄のみとなるタイプ 次に死亡保障がなく、あくまで貯蓄を目的とした保険商品を紹介します。 具体的には以下2つです。 外貨建て個人年金 変額個人年金 詳しくは「 個人年金はおすすめできる?加入のメリットと種類を解説 」をご覧いただくとして、1つずつ紹介します。 2-1-1.