今回も実験 プロトコール です。 この目的は、自分の頭の整理・知識の確認の他に、いわゆる「おばあちゃんの知恵袋」的な、文献や教科書に載っていないけど知ってるとちょっと役立つようなことを記録しておくことです。 正確性には注意を払っておりますが、利用の際はご注意ください。 レンチウイルス関連の記事は以下の通り↓ レンチウイルスベクターの保存方法【短期保存】 - こりんの基礎医学研究日記 レンチウイルスベクターの保存方法 - こりんの基礎医学研究日記 【実験プロトコール】ウイルスタイターチェック - こりんの基礎医学研究日記 以下の プロトコール をもとに、ラボの先輩に教えてもらった方法です↓ 直径10㎝ディッシュを用意し、Poly-L-Lysineコーティングする。 ※Poly-L-Lysine(PLL)とは? 細胞膜上の陰イオンと培養容器表面上の 陽イオン との間の相互作用を促進する。つまりプラスチックやガラス面への細胞接着を促進する効果がある。 →省略してもあまり実験に影響ない印象 <やり方> 0.
A6 SIN( s elf in activating)ベクターは、3'LTRのU3にあるエンハンサー/プロモーター領域を削除してあります。ベクターRNAは細胞に感染後、逆転写の過程で3'LTRのU3が5'LTRのU3にコピーされるので、SINベクターの場合、染色体に組み込まれるベクターDNAのLTRは両方ともプロモーター活性を持たないことになり、安全性の高いベクターとなっています。詳しい説明は、「 レンチウイルスベクターについて 」を参照してください。 Q7 パッケージング細胞はないのか? A7 パッケージング細胞はありますが、pol遺伝子にコードされているプロテアーゼやVSV-Gの発現が細胞にとって毒性が高いので、これらの遺伝子がベクターを産生させる時だけ発現するようにtet inducible systemを使っています。しかし、通常のラボでの解析目的に使用する量のベクターを得るためには、その扱いが煩雑すぎるのであまりお勧めしておりません。同じベクターが大量に必要な場合には、パッケージング細胞にVector plasmidをtransfectionしてstable lineを樹立した方がよい場合もあります。 Q8 ベクタープラスミドにはZeocin耐性遺伝子が組込まれていますが、細胞にウイルスを感染させた後のtransformantのselectionに使用可能でしょうか? A8 Zeocin耐性遺伝子はLTRの外側にありますのでウイルスゲノムには含まれません。従いまして、ウイルス感染細胞をZeocinでselectionすることはできません。大腸菌でのselectionまたはプラスミドをパッケージング細胞にtransfectionしてstable transformantをとるためのselectionに使用します。 Q9 超遠心以外でウイルスを濃縮する方法はないのか?
25~0. 5 ml/cm 2 (プレート底面が溶液で浸る程度)となるようにRetroNectin希釈液をプレート *2 に加えてプレート全底面に広げ、室温で2時間または4℃で一晩放置する。24ウェルプレートの場合には1ウェルあたり0. 5 ml、6ウェルプレートの場合には1ウェルあたり2 mlのRetroNectin希釈液を加える。 *2 プレートは必ずノントリートメントタイプのものを使用する。 RetroNectin希釈液を除き、適当量の2% BSA/PBS溶液を加えてブロッキングを行う。室温で30分間放置する *3 。24ウェルプレートの場合は0. 5 ml/well、6ウェルプレートの場合は2 ml/wellのブロッキング液を加える。 *3 すぐに使用する場合は、2% BSA/PBS溶液によるブロッキング操作は省くことができる。この場合、ステップ4のPBSまたはHBSS/HEPESによる洗浄を2回繰り返す。 2% BSA/PBS溶液を除き、適当量のPBSまたはHBSS/HEPESで一度洗浄し、それらを除去した後、プレートを保存する。このプレートをRetroNectinコートプレート *4 とする。 *4 2% BSA/PBS 溶液によるブロッキング操作を行った場合は、容器のふたをパラフィルムなどでシールし、4℃で1週間の保存が可能である。 RetroNectin Bound Virus(RBV)-Spin法(遠心感染) 注 マルチウェルプレートの場合、ウェル位置により導入率に差が生じることがある。できる限りプレート中央に近いウェルを使用することをお勧めする。 目的遺伝子を持つ組換えウイルス液の原液、あるいは希釈液をRetroNectinコートプレート上に125~250 μl/cm 2 となるように加える。 32℃で2, 000× g 、2時間の遠心を行い、RetroNectinへウイルス粒子を吸着させる。 プレート上が乾燥しないように注意しながら、ウイルス液を除去し、適当量のPBSまたは0. 1~2%のアルブミン(BSAやHSA)を含むPBSを添加する(溶液は細胞へのウイルス感染直前まで除かない)。 標的細胞懸濁液を調製する。適切な細胞濃度は標的細胞の大きさや増殖率によって異なる。細胞に応じて、0. 05~5×10 5 cells/cm 2 の範囲で検討する。 3.
こんにちは! ご無沙汰しております! 連休が終わり、昨日から当店は通常営業に戻っています! 本日は7月よりブログでご紹介していました【カテゴライズビュート】の第6弾(ラスト)をお送りいたします!! ビュートと言えば、 美しく遊ぶ人→美遊人(びゆうと)→ビュート という由来から名づけられているのは有名ですよね! そこで全6回に渡り更新してきたカテゴライズビュートのフィナーレを飾るテーマは 『Beauty -美-』 でございます!!!! ここはやはりビュートの真髄でもある美しさをフィーチャーしたカテゴリーで締めたいと思います! 上品さと美しさを兼ね揃えた3台(内1台は先日売約となりました)のビュートをご紹介いたします♪ ①光岡ビュート1. 0 10th Anniversary ワインレッド×ブラック 年式:H15年 車両価格:148万円 走行距離:7. 9万km CVT. 木目調インパネ. 黒内装. レザー調シート. 社外新品SDナビ(フルセグ)再生可. ミュージックサーバー/Bluetooth対応バックカメラ 平成15年の光岡ビュート10周年を記念して製作された特別車です。 大人の佇まいと妖艶さを持った美しいワインレッドとブラックを組み合わせたツートンカラーです。 ワインレッドはきらびやかな派手さの面では控えめですが、それでも華やかさを感じるのでとても絶妙なバランスの色であると思っています。 ルーフがブラックなのでよりシックな雰囲気が引き立って、かっこよく気高いカラーリングになっているといると思っています。 ②光岡ビュート 12ST MyViewt 25th Anniversary ブラックローズパール 年式:H30年 車両価格:358. 6万円 走行距離:1000km CVT. 【ミツオカリムジン "おくりぐるま" 新型霊柩車 新車情報】不思議な偶然！？映画『おくりびと』米・アカデミー賞受賞翌日に、人生の最後に乗る『おくりぐるま』が発表された！. 本革シート. 本革巻ステアリング. クラッシックドアトリム. クラッシックセンターコンソール. パーセルボード(ウッドタイプ). 純正新品SDナビ(フルセグTV)再生可. ミュージックサーバー/Bluetooth対応バックカメラ ビュートの25周年を記念してつくられた特別仕様車です。 色は特別外装色のブラックローズパールで塗装! 25周年限定のエンブレムとグリルバッチが施されていることもあり、あらゆる面で特別感を味わえるゴージャスで美しいビュートです! 外装だけではなく、クラシックに特化した内装もとても美しく、セレブ気分を味わえます。 アイボリーの本革シートには外装と同じ色でパイピング&ステッチがされているので、可愛らしさもあります。 ドアトリムも同じくアイボリーの本革仕様なので、内装が清楚に見えるのもポイントです◎ 他にもウッドインパネやウッドタイプのパーセルボードなど、ウッド素材の主張もあって、よりクラシカルな空気に包まれる車内になっていますよ♪ ③光岡ビュート 1.
ミツオカモータータイランドCo., Ltd.
光岡自動車は、新型霊柩車「おくりぐるま ミツオカリムジンtype2-04」を2月25日に発売する。価格は522万9000円~558万6000円。 ミツオカリムジンtype2-04は、トヨタ自動車の「カローラ フィールダー」をベースとした霊柩車。「おくりぐるま」という車名が与えられているが、光岡自動車によれば米アカデミー賞の外国語映画賞を受賞した映画「おくりびと」の滝田洋二郎監督が光岡自動車の本社がある富山県出身なほか、原作の「納棺夫日記」の著者である青木新門氏も富山県在住だと言う。 特徴としては、ボディサイズが5170mm×1690mm×1460mm(全長×全幅×全高)で、同社が製造している従来製品の全長7000mm前後と比較して取り回しやすいサイズを実現。最小回転半径も6. 1mとなる。エンジンは直列4気筒 DOHCの1. 5リッター、または1. 8リッターエンジンを搭載し、トランスミッションはCVTを、駆動方式は2WD(FF)を採用している。 グレードと価格は、1. 5リッターの「ST」が522万9000円、1. 8リッターの「DLX」が558万6000円。ボディーカラーは「ブラックメタリック」「シルバーメタリック」を用意する。受注生産のため、標準以外のボディーカラーや4WD車、ワンメイク商品の相談にも応じるとしている。